Visualización de la exocitosis de vesículas sinápticas en neuronas de la corteza de ratón normal y de ratón con trisomía 16 utilizando vacht-phluorin / Jacqueline Alejandra Vásquez Navarrete.

Los cambios en la excitabilidad neuronal, la eficacia sináptica, y en general la señalización celular, a menudo resultan de la inserción de moléculas en la membrana plasmática (PM). En este estudio nosotros hemos utilizado las líneas celulares derivada de la corteza de ratón normal (CNh) y de ratón con trisomía 16 (CTb), con el fin de monitorear la exocitosis de vesículas sinápticas durante eventos espontáneos e inducidos con DMPP. Para ello utilizamos un sensor de pH (pHluorina eclíptica) unida al transportador vesicular de acetilcolina la cual constituye un marcador de eventos exocitoticos debido a que se halla “apagado” a pHs ácidos (como el lumen vesicular) y fluorece intensamente al entrar en contacto con el medio alcalino del espacio extracelular. Para el desarrollo de este estudio se utilizó la microscopia de fluorescencia de reflexión total interna (TIRF), este método utiliza un campo evanescente para excitar la fluorescencia dentro de los 100-200 nm por encima del fondo de cristal de una placa de cultivo, y de esta manera nos permite monitorear lo que está ocurriendo en las cercanías de la membrana plasmática. En teoría se sabe que el transportador vesicular de la acetilcolina, se localiza en la membrana de vesículas sinápticas y también en la membrana plasmática (Wienisch y Klingauf, 2006) y (Fernandez y Ryan, 2006). El primer grupo de experimentos se realizó para observar la expresión de pHluorina en la membrana plasmática y a nivel de organelos ácidos como vesículas sinápticas mediante un protocolo de acidificación extracelular repetitiva. Obteniendo de este modo un método más preciso de control de moléculas marcadas con fluorescencia que se añaden a la PM.